1. V kultivační plotně namočte podložní sklíčka, která byla přelezena, s PBS třikrát pokaždé na 3 minuty.
2. Fixujte sklíčka 4% paraformaldehydem po dobu 15 minut a namočte sklíčka do PBS na 3x, pokaždé na 3 minuty.
3. Permeabilizujte pomocí 0,5 procenta Tritonu X-100 (připraveného v PBS) po dobu 20 minut při pokojové teplotě (pro antigeny exprimované na buněčné membráně je tento krok vynechán).
4. Blokování séra: sklíčka ponořte 3x na 3 minuty do PBS, osušte PBS absorpčním papírem, přidejte na sklíčka normální kozí sérum (za předpokladu, že sekundárním zdrojem protilátek je koza) a blokujte při pokojové teplotě po dobu 30 min.
5. Přidejte primární protilátku: Absorbujte blokovací roztok savým papírem, nepromývejte, přidejte dostatečné množství naředěné primární protilátky na každé sklíčko a vložte do vlhké krabičky, inkubujte přes noc při 4 stupních.
6. Přidejte fluorescenční sekundární protilátku: ponořte sklíčka do PBST na 3x, pokaždé na 3 minuty, absorbujte přebytečnou tekutinu na sklíčkách pomocí absorpčního papíru, přidejte naředěnou fluorescenční sekundární protilátku po kapkách, inkubujte při 20-37 stupni po dobu 1 hodiny v mokré krabičce namočte do PBST Slice 3x, pokaždé 3 min.
Poznámka: Po přidání fluorescenční sekundární protilátky by měly být všechny následující kroky prováděny pokud možno na tmavém místě.
7. Blokování séra: odsajte tekutinu savým papírem, na podložní sklíčko kápněte normální kozí sérum (za předpokladu, že sekundárním zdrojem protilátky je koza) a blokujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut.
8. Přidejte primární protilátku: Absorbujte blokovací roztok absorpčním papírem, nepromývejte, poté přidejte po kapkách naředěnou primární protilátku a po přidání primární protilátky inkubujte přes noc ve 4stupňovém vlhkém boxu ve tmě. (Poznámka: druh druhé primární protilátky se liší od druhu první primární protilátky, jako je myš a králík)
9. Přidejte fluorescenční sekundární protilátku: ponořte sklíčka do PBST na 3x, pokaždé na 3 minuty, absorbujte přebytečnou tekutinu na sklíčkách pomocí absorpčního papíru, přidejte naředěnou fluorescenční sekundární protilátku po kapkách, inkubujte při 20-37 stupni po dobu 1 hodiny v mokré krabičce namočte do PBST Slice 3x, pokaždé 3 min. (Poznámka: Pokud je pro detekci první protilátky vybrána červená fluorescence, druhá musí vybrat jiné barvy fluorescence)
10. Kontrastní barvení jader: DAPI byl přidán po kapkách a inkubován ve tmě po dobu 5 minut, vzorky byly obarveny a přebytek DAPI byl smyt PBST 5 min x 4 krát.
11. Osušte tekutinu na podložním sklíčku savým papírem, uzavřete sklíčko montážní tekutinou obsahující antifluorescenční zhášedlo a pozorujte a sbírejte snímky pod fluorescenčním mikroskopem.