Když jste právě promovali a vstoupili do zaměstnání, čelíte spoustě podstatných jmen, která čelí kvantitativním PCR experimentům v reálném čase. Jste zmateni tím, kde začít? Co znamená amplifikační křivka, standardní křivka, práh, hodnota CT, křivka tání a základní linie? Fluorescenční obrazy z těchto experimentů jsou příliš jasné, ale nedokážu je identifikovat. Dnes vás provedeme učením těchto znalostí a konceptů ve dvou částech: technické termíny a často kladené otázky.
Část I Odborné podmínky
1. Amplifikační křivka
Amplifikační křivka se týká křivky, kde číslo cyklu je úsečka a intenzita fluorescence v reálném čase během reakce je ordináta během PCR.
2. Základní linie
Základní linie označuje malou změnu fluorescenčního signálu během prvních několika cyklů amplifikační reakce PCR. Úroveň signálu se zobrazuje blízko přímky, což je základní čára.
3. Nastavení prahu fluorescence
Typicky se jako signál fluorescenčního pozadí používá fluorescenční signál prvních 15 cyklů PCR reakce a práh fluorescence je 10násobek standardní odchylky fluorescenčního signálu během 3-15 cyklů PCR a práh fluorescence je nastavena během exponenciální fáze PCR amplifikace. Typicky má každý přístroj před použitím svůj práh fluorescence.
4. Hodnota CT
Hodnota CT představuje počet cyklů, které nastanou pro každou zkumavku PCR, když fluorescenční signál dosáhne nastavené prahové hodnoty. Z výzkumu víme, že existuje lineární vztah mezi hodnotou CT každé šablony a logaritmem počátečního počtu kopií této šablony. Čím vyšší je počáteční počet kopií, tím menší je hodnota CT a naopak. Pomocí standardů se známými počátečními čísly kopií lze vytvořit kalibrační křivku, kde osa x představuje logaritmus počátečního počtu kopií, zatímco ordináta představuje hodnotu CT. Proto, pokud je získána hodnota CT neznámého vzorku, lze počáteční počet kopií vzorku vypočítat ze standardní křivky.
Vědět více
Existuje několik indikátorů pro posouzení, zda je křivka zesílení dobrá nebo ne:
Odpověď: Inflexní bod křivky je zřejmý, zejména je zřejmá exponenciální fáze vzorku nízké těžké frakce, celková rovnoběžnost amplifikační křivky je velmi dobrá, základní linie je plochá, nedochází k žádnému vzestupu a zesílení křivka vzorku nízkoúrovňové exponenciální fáze koncentrace je velmi dobrá. zřejmé.
B: Sklon exponenciální fáze křivky je přímo úměrný účinnosti zesílení, čím větší je sklon, tím vyšší je účinnost zesílení.
C: Standardní základní linie je plochá nebo mírně klesající, bez zjevného vzestupného trendu.
D: Paralelnost amplifikačních křivek pro každou zkumavku je dobrá, což ukazuje, že účinnost amplifikace každé reakční zkumavky je podobná.
5. Křivka tání
Když se PCR produkt zahřívá, jak teplota stoupá, dvouvláknový amplifikační produkt postupně disociuje, což má za následek pokles intenzity fluorescence. Při dosažení určité teploty se oddělí velké množství produktu, což má za následek prudký pokles fluorescence. Použití této funkce spolu s různými hodnotami TM pro různé produkty PCR se také liší v teplotě, při které fluorescenční signál rychle klesá, což může být dobrý způsob, jak identifikovat specificitu PCR.
6. Křivka tání (pomocí logaritmické křivky)
Vrcholový graf je tvořen logaritmem křivky tání pro intuitivnější zobrazení situace fragmentů produktu. Protože teplota tání je hodnota TM fragmentu DNA, lze určit určité parametry ovlivňující hodnotu TM fragmentu DNA, jako je velikost fragmentu, obsah GC atd. Obecně se podle našeho principu návrhu primeru obvykle říká že délka amplifikovaného produktu je v rozsahu 80-300bp a teplota tání by měla být mezi 80 a 90 stupni .
Odpověď: Pokud je mezi 80° a 90° pouze jeden hlavní pík, znamená to, že PCR v reálném čase je perfektní.
B: Pokud se hlavní pík objeví mezi 80 stupni a 90 stupni a pík nečistot se objeví pod 80 stupni, je v zásadě uvažován primer-dimer. To je dobrá možnost, jak zkusit vyřešit zvýšením teploty žíhání.
C: Pokud se hlavní vrchol objeví mezi 80 stupni a 90 stupni a při zvýšení teploty se objeví putující vrchol, je v zásadě zvažována kontaminace DNA. A DNA je potřeba odstranit v počátečních fázích experimentu.
7. Standardní křivka
Standardní standardy byly naředěny na různé koncentrace a použity jako templáty pro PCR reakce. Standardní křivka je vynesena s logaritmem standardního počtu kopií jako osa x a naměřenou hodnotou CT jako ordináta. Při kvantifikaci neznámého vzorku lze počet kopií vzorku získat ze standardní křivky na základě hodnoty CT neznámého vzorku. Standardní křivky jsou velmi důležité pro absolutní kvantifikaci.
druhá část. společný problém
Q1: Jaký je rozdíl mezi RT-PCR, QPCR, PCR v reálném čase a RT-PCR v reálném čase?
A1: RT-PCR je reverzní transkripční PCR, což je široce používaná varianta polymerázové řetězové reakce. V RT-PCR je řetězec RNA reverzně transkribován do komplementární DNA, která se pak používá jako templát pro PCR k amplifikaci DNA pomocí PCR.
Real-time PCR a QPCR jsou to samé, obě jsou kvantitativní PCR v reálném čase, což znamená, že v každém cyklu během procesu PCR dochází k záznamu dat v reálném čase. Tímto způsobem lze přesně analyzovat počet spouštěcích šablon.
Ačkoli se zdá, že PCR v reálném čase i PCR s reverzní transkripcí jsou zkráceny jako RT-PCR, podle mezinárodní konvence se RT-PCR vztahuje specificky na PCR s reverzní transkripcí, zatímco PCR v reálném čase je často zkrácena jako qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - time PCR).
RT-PCR v reálném čase (RT-QPCR) je typ reverzní transkripční PCR, která kombinuje fluorescenční kvantitativní techniky: nejprve reverzní transkripce z RNA k získání cDNA (RT), následovaná kvantitativní analýzou pomocí PCR v reálném čase (QPCR).
Otázka 2: Proč je délka amplifikovaného fragmentu produktu fluorescenční kvantitativní PCR kontrolována v rozsahu 80-300 bp?
A2: Délka každé genové sekvence je různá, některé z nich mají několik Kb a stovky BP. Když však navrhujeme primer, potřebujeme pouze vyžadovat, aby délka produktu byla 80-300bp, a příliš krátký nebo příliš dlouhý není vhodný pro kvantitativní PCR detekci.
Fragmenty produktu jsou příliš krátké na to, aby je bylo možné odlišit od primer-dimerů. Délka primer-dimer je asi 30-40 bp, když je menší než 80 bp, je obtížné rozlišit, zda se jedná o primer-dimer nebo produkt. Pokud je fragment produktu příliš dlouhý, přesahuje 300 bp, snadno to povede k nízké účinnosti amplifikace a množství genu nelze účinně detekovat.
Když například spočítáte počet lidí ve třídě, stačí spočítat, kolik tam je úst. Totéž platí při testování genů. Potřebujete pouze detekovat určitou sekvenci genu, aby reprezentovala celou sekvenci. Je snadné udělat chybu, pokud při počítání lidí počítáte jak ústa, tak nos, uši a brýle.
Q3: Jaká je optimální délka pro návrh základního nátěru?
Odpověď 3: Obecně řečeno, délky primerů v rozsahu 20-24bp jsou dobré. Samozřejmě musíme při návrhu primeru věnovat pozornost hodnotě TM primeru, protože souvisí s optimální teplotou žíhání. Po mnoha experimentech bylo prokázáno, že 60 stupňů je dobrá hodnota TM. Nízká teplota žíhání může snadno vést k nespecifické amplifikaci, zatímco vysoká teplota žíhání obvykle vede k nízké účinnosti amplifikace, pozdnímu vrcholu amplifikační křivky a zpožděné hodnotě CT.
Otázka 4: Ovlivňuje množství odebraného vzorku výsledky experimentu?
A4: Ne. Je zřejmé, že čím více vzorků bylo odebráno, tím více extrahované RNA, tím více cDNA a tím více cílových fragmentů bylo. Pro absolutní kvantifikaci je nutné vypočítat počet kopií cílového fragmentu a množství odebraného vzorku rozhodně ovlivní výsledky experimentu. Například detekce viru hepatitidy C HBV v krvi spočívá v detekci obsahu HBV v určitém množství (1 ml) krve.
Pro relativní kvantifikaci běžně používanou ve vědeckém výzkumu nemá počet vzorků nic společného s experimentálními výsledky, protože relativní kvantifikace se týká srovnání mezi cílovým genem a referenčním genem. Jen je prosím považujte za upstream a downstream fragmenty přítomné ve stejném vláknu nukleové kyseliny. Pokud je velikost vzorku velká, referenční i cílové geny jsou zvýšeny ve stejných poměrech současně, což neovlivňuje výsledky.
Q5: Ovlivní účinnost reverzní transkriptázy výsledky experimentu?
A5: Stejné jako výše. Všimněte si, že chceme vyšší účinnost RT, ale preferujeme, aby byl enzym RT relativně stabilní a získal jednotné výsledky. Půjde o test optimalizovaných schopností reverzních transkripčních sad velkých společností.
Otázka 6: Ovlivňuje účinnost enzymu TAQ výsledky experimentu?
A6: Účinnost enzymu TAQ je poměrně velká. Obvykle jsou vyžadovány enzymy taq s horkým startem, které jsou relativně účinné. U komerčních fluorescenčních kvantitativních kitů každý výrobce optimalizuje účinnost nejlepšího stavu podle vlastních produktů blízkou 100 procentům, pokud je účinnost příliš nízká, nelze získat experimentální výsledky. U produktů různých společností je to měřítko kvality.
Otázka 7: Ovlivňuje množství fluorescenčního barviva výsledky experimentu?
A7: Ano, bude. Pokud je fluorochrom příliš nasycený, může u některých nástrojů způsobovat rušení šumem. Pokud fluorochrom není nasycený a hodnota fluorescence je příliš nízká, brzy vstoupí do fáze plateau a amplifikační křivka bude plochá. Ve fluorescenčním kvantitativním experimentu je vidět hlavně hodnota CT, takže není důležité, aby křivka pozdní amplifikace vstoupila do fáze plató, ale obraz není dostatečně krásný. Pokud jste si museli vybrat, začněte výběrem fluorochromu, který je o něco méně nasycený. Při použití stejného přípravku od stejné firmy je však jeho účinek v podstatě zanedbatelný.
Otázka 8: Ovlivní přenos zkumavky PCR výsledky experimentu?
A8: Ano. U stejné šarže spotřebního materiálu od stejného výrobce však lze tento efekt ignorovat. To je dobrá volba a je nejlepší použít 96-jamkovou destičku s membránou s vysokou propustností, aby se minimalizoval vliv propustnosti světla spotřebního materiálu.
Q9: Budou mít chyby během provozu vliv na výsledky experimentu?
A9: Vliv provozního procesu se projevuje především v uniformitě. Homogenita znamená, že všechny složky v systému jsou rovnoměrně smíchány dohromady a blesková centrifugace může tento problém vyřešit. Pro začátečníky je navíc nejlepší upravit systém PCR na více než 20 palců a příliš malý systém je náchylnější k chybám. Pokud je teplota nasedání správně optimalizována, je účinek koncentrace primeru na CT minimalizován. A budete vědět, že některým provozním chybám (jako je koncentrace primeru) lze předejít optimalizací teploty žíhání.
Shrnout
Výše jsou některé otázky a otázky, se kterými se nováčci během experimentu často setkávají, doufáme, že vám tyto otázky pomohou vyřešit nějaký zmatek. Experimentování je proces generování chaosu a řešení problémů, doufejme, že z toho něco získáte. Děkujeme za přečtení a uvidíme se příště!
