1. Obnova
●1. Vyjměte kryozkumavku z kapalného dusíku, okamžitě ji vložte do vodní lázně o teplotě 37 stupňů a mírně s ní zatřeste. Poté, co se kapalina roztaví (asi 1-1,5 minuty), vyjměte ji, nastříkejte trochu alkoholu a položte ji na ultračistý pracovní stůl.
●2. Nasajte výše uvedenou buněčnou suspenzi do 15ml centrifugační zkumavky naplněné 10ml média (promyjte kryokonzervační zkumavku médiem, aby se smyly všechny buňky ulpívající na stěně) a centrifugujte při 1000 ot./min. po dobu 5 minut.
●3. Slijte supernatant a přidejte 1 ml média pro suspendování buněk. Nasajte do 10 cm Petriho misky obsahující 10 ml kultivačního média a jemně protřepejte tam a zpět, aby se buňky v Petriho misce rovnoměrně rozložily.
●4. Označte typ buňky a datum, název kultivátoru atd. a umístěte ji do CO2 inkubátoru pro kultivaci. Poté, co buňky přilnou ke stěně, vyměňte médium.
●5. Médium vyměňujte každé 3 dny.
2. Průchod
●1. Průchod, když pokrytí buněk v kultivační misce dosáhne 80 procent -90 procent .
●2. Nasajte původní médium.
●3. Přidejte vhodný trypsin (jen tolik, aby pokryl buňky) a trávte 1-2 minut.
●4. Poté, co se buňky zakulatí, přidejte stejný objem média obsahujícího sérum, abyste ukončili štěpení.
●5. Pomocí pipety suspendujte buňky pipetováním.
●6. Nasajte buňky do 15ml centrifugační zkumavky a centrifugujte při 1000 ot./min. po dobu 5 minut.
●7. Slijte supernatant, přidejte 1-2ml média a nafoukněte buňky.
●8. Přeneste buňky do několika misek v závislosti na typu buněk. Obecně existuje 5 rakovinných buněk a 3 normální buňky. Pokračujte v kultivaci.
3. Kryokonzervace Buňky štěpte a odstřeďte (ibid.). Buňky suspendujte v připraveném zmrazovacím roztoku a rozdělte je do sterilizovaných kryozkumavek, nechte je několik minut stát a uveďte typ buněk a datum kryokonzervace. 4 stupně po dobu 30 minut, -20 stupňů po dobu 30 minut, -80 stupňů přes noc a poté vložte do kapalného dusíku pro uskladnění. Příprava kryokonzervačního roztoku: 70 procent kompletního média plus 20 procent FBS plus 10 procent DMSO. DMSO by měl být pomalu přidáván po kapkách, protřepává se při odkapávání.
